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RB∕T 00*-2019 转基因检测方法验证指南.pdf

RB∕T 00*-2019 转基因检测方法验证指南.pdf简介：

"RB∕T 00*-2019 转基因检测方法验证指南.pdf" 是一份关于转基因检测方法验证的行业标准或技术规范。"RB"可能是某个机构或组织的缩写，"T 00*-2019"则可能是标准的发布年份和顺序号。这份指南详细规定了转基因检测过程中所需的方法验证的步骤、程序、标准和要求，包括但不限于检测方法的准确性、可靠性、灵敏度、特异性和可重复性。它可能涵盖基因分析、PCR检测、抗原检测等各类转基因检测技术，目的是为了确保转基因产品的检测结果的科学性和公正性，以保护消费者权益和维护生物技术行业的规范操作。对于从事转基因检测的实验室和相关机构来说，这是遵循和执行的重要参考文件。

RB∕T 00*-2019 转基因检测方法验证指南.pdf部分内容预览：

下列术语和定义适用于本文件。 2.1 验证verification 提供客观证据，证明给定项目满足规定要求。 [ISO/IEC17025:2017,定义3.8] 注：验证一个实验室能够充分按照标准要求进行操作。需要实验室提供客观证据，证明对于所用的样品基质，能满 足检测方法规定的性能指标。通常，（标准）关键要求是真实度（一般用偏差形式表示）和精确度（一般为重复性 和再现性），反映在测量不确定度中。客观证据是从实验室实际数据中得到的真实度和精确度。 2.2 确认validation 对规定要求满足预期用途的验证。 [ISO/IEC17025:2017,定义3.9] 2.3 定量检测低限 limitofquantification LOQ 是指被检测的样品在合适的精确度水平上能被检测出的最低含量或浓度，并且依据ISO5725条款 [2]或[3]，经过合作实验的满意证明或单一实验室的确认。 [GB/T19*95.1—200*,定义3.1.*] 2.* 检测低限limitofdetection LOD 是指被检测物能够被可靠检出的最低浓度或含量。但是不必进行定量，并且已经经过合作实验的 证明或单一实验室的确认。 [GB/T19*95.1—200*,定义3.1.5] 2.5 真实度trueness 大量实验结果的平均值和认可参考值的一致性。 注：真实度（可信度）的量度标准通常是以斜率来表示的。可信度也就是所提到的“平均值的正确度”。 『GB/T19*95.1—200*,定义3.1.8]

RB/T00*—2019

精确度precision

精确度precision 在规定条件下所获得的独立测试结果之间的一致性。 GB/T19*95.1—200*DB*3／T 1*05-2019标准下载，定义3.1.9

清确度precision 在规定务件下所获

本标准包括定性和定量转基因检测方法的验证指标。其中，定性方法指标包括DNA提取和纯化 的验证，DNA浓度的验证，DNA提取物中抑制剂的验证，RSDr的验证，LOD的验证；定量方法指标包 括DNA提取和纯化的验证，DNA浓度的验证，DNA提取物中抑制剂的验证，动态范围、R²系数、扩增 效率的验证，真实度的验证，RSDr的验证，LOQ的验证。

*.2DNA提取和纯化的验证

操作时样品每次分2份，每份至少2次（推荐3次进行DNA的提取，不宜在同一关内进行，应由 不同的操作者完成。提取的DNA应达到一定的浓度和质量标准，DNA提取效果通过验证抑制剂的存 在进行评价，评价方法参见附录A。适用于一种样品基质的DNA提取方法可能不适用于其他基质。 以上步骤需要针对不同样品基质进行。对于DNA提取方法的验证可采用内源基因，因此测试的样品 基质不一定要含有转基因成分。

*.3DNA浓度的验证

实验室在验证过程中，提取DNA的浓度应和标准方法规定的浓度进行比较。实验室提取的DNA 浓度在后续检测时应至少达到规定的LOD/LOQ。实验室提取的DNA浓度对LOD的影响参见附 录B。

PCR分析，每个稀释至少做2个PCR平行实验，从而得到标准曲线。 *.*.2检测抑制剂的PCR实验优先选择内源基因。工作溶液中总的DNA量应至少和方法验证过程 中及日常检测中用的DNA的量相同。 *.*.3当实验室测量C.值和工作溶液推测C，值的平均差值△C，小于0.5，并且抑制剂曲线斜率在 一3.*～一3.1时，即说明DNA提取物中无抑制剂影响。抑制剂实验的示例参见附录A。 *.*.*如果提取的DNA含有抑制剂，要对DNA进一步纯化或过滤稀释到观察不到PCR抑制剂的 水平。

*.5动态范围、R2系数、扩增效率的验证

*.5.1动态范围、R²系数和扩增效率在测量其他参数，如真实度和精确度时，从标准曲线可以自动得 出。应采用至少两条标准曲线的平均值（见表1）。 *.5.2动态范围应覆盖预期值。可用转基因成分百分比或拷贝数范围表示（例如，目标转基因浓度为 0.9%的动态范围是0.09%和*.5%，目标基因拷贝数为500拷贝的动态范围是50和2500拷贝）。 *.5.3对定性和定量方法，标准曲线斜率的平均值应在一3.*～一3.1，相当于扩增效率在90%到110% 之间。R²系数的平均值应大于或等于0.98。

*.*.1检测条件（反应体积、PCR仪等）应和日常检测一致。至少要得到1*个PCR平行的结果。检测 的设计实例见表1、图1和图2。 *.*.2真实度应该接近规定值，或根据方法的预期使用需要，至少接近LOQ的水平。真实度的测量 可以用CRM的至少2个浓度（如0.1%和1%）进行，适用时，用动态范围的上限（如5%）作为第3个浓 度。或者，用一个更高浓度的标准物质配制成低浓度的标准物质（如1%），中间浓度阳性对照的制备方 法参见附录C。基于实时荧光PCR的转基因含量平均值、标准偏差和相对可重复性标准偏差的计算方 法参见附录D。 *.*.3如果没有CRM进行真实度的评估，可以用能力验证样品或能力验证的Z比分数来评价方法的 真实度。 *.*.*真实度的可接受参考值应在±25%之间,或Z比分数在±2之间。

*.7.1实验室可用RSD，来评估方法的重复性。重复性的评估和真实度的评估方法相似，是在重复条 件下通过PCR平行实验进行计算。重复性适用于所有转基因水平的测试。检测条件（反应体积、PCR 仪等)应和日常检测一致，至少要得到1*个独立测量结果。检测的设计实例见表1、图1和图2。标准 偏差和相对可重复性标准偏差的计算方法参见附录D。 *.7.2RSD.应小于或等于25%，并覆盖方法的动态范围

*.8.1为了建立准确的LOQrel，需要用低浓度的转基因标准样品提取DNA配制溶液。当实验室验证 LOQre时，0.1%的阳性对照样品可以用目标转基因的10次PCR平行实验和内源基因的10次PCR平 行实验进行分析。LOQrel的RSD应小于25%。 *.8.2当实验室验证LOQ.b时，1%的已知阳性对照样品的一系列稀释可以用10次PCR平行计算（如 80、*0、*0、20、10、5和1个拷贝）。L0Qbs可以用一系列的稀释液中的最后一个稀释度进行评估，测量 的RSD要小于25%。标准曲线应该覆盖LOQabs值。 *.8.3进行以上两个指标的验证时，概率分布建议1个拷贝应有大约30%的阴性结果。因此，1个拷贝 的稀释液至少一个平行结果应是阴性的。只要标准曲线满足R²和斜率/效率的要求，10次PCR平行

RB/T00*—2019

实验的平均值可作为绘制标准曲线白 标准曲线其他点的数据只需要在每个点做2个 PCR平行实验。当标准方法有规定时 节法规定的要求

*.9.1当实验室验证LOD时，一个低转基因浓度的阳性对照样品可以用10次PCR平行计算，如果 所有平行的结果都是阳性，这表示LODrel小于或等于阳性对照水平。 *.9.2当实验室验证LODabs时，计算一个方法95%置信水平的LODbs，需要每个浓度进行*0个PCR 平行。由于此方法并不实用，可用计算少量平行实验的方法进行LODbs的大致评估，如10次平行实验 的假阴性率。假阴性率应小于5%，如进行10个PCR平行实验，其结果应都是阳性。 *.9.3假阴性率是指一个已知阳性样品被检测成阴性的可能性。当分析物的量接近方法的LOD时， 假阴性率会上升。基于对已知方法性能的推测，选取适宜的稀释系列，使其能代表高于和低于预期 LODbs的间隔（如20、10、5和1个拷贝）。10个平行都是阳性的最低浓度是预估的LODbs。概率分布 建议1个拷贝应有大约30%的阴性结果。因此，为了验证稀释系列正确的拷贝数，1个拷贝的稀释液至 少一个平行实验结果应是阴性的，见表1。当标准方法有规定时，LOD应优于方法规定的要求

JTT 532-2019 桥梁用碳纤维布（板）表1定实时荧光PCR方法的验证设置实例

附录A （资料性附录） DNA提取效果的评价方法

抑制PCR反应的物质可以通过与DNA模板反应、干扰DNA聚合酶活性或降低聚合酶辅助因子 （Mg?+）的效率而影响目标DNA扩增的效率。DNA提取步骤可以在很大程度上消除或降低PCR抑制 物的量。但是，一个样品中抑制剂的最终量很大程度上取决于样品的性质。样品被加工的程度越深， DNA断裂的可能性越大。植物DNA还会受到次生代谢物如多酚、脂类和能够与DNA链聚合的多糖 的影响。DNA抑制剂还可能是DNA提取步骤中添加的试剂：如KC1和NaCI、离子洗涤剂、乙醇、异丙 醇和苯酚等。 为了在DNA的准备工作中检测是否存在PCR抑制物，可以采取不同的措施。本附录说明了如何 使用未稀释的样品提取物的反应效率（斜率和R²）作为验收标准来评估PCR抑制物是否存在。 抑制的作用基本上取决于抑制物的浓度。当DNA被稀释时，抑制物的效果通常会在DNA低浓度 时被降低或消除。对连续稀释样品的反应效率的评价，可以通过不含抑制剂的未稀释样品的理论C， （临界循环次数）和测量C，的对比，可以得到评估DNA质量的信息。如果只有最高DNA浓度显示抑 制，则低浓度DNA可以用于定量，但是会影响实际的LOD和LOQ值。 但是，在特定情况下连接在DNA片段上的抑制物不会通过样品稀释而被消除，这样就会导致可以 扩增的DNA拷贝数少于样品中预期的DNA浓度

可以通过扩增内源基因序列来证明是否含有抑制剂。验证试验中选取样品的DNA提取平行，按 照1：*、1：1*、1：**和1：25*对其进行*倍梯度稀释，对上述每个梯度都进行2个PCR平行实验， 为了评估抑制剂是否存在，*个系列稀释的样品的C，值从稀释因子的对数中得到，并用线性回归计算 得到一个等式。从线性回归推算出的“未稀释”样品的C，值与同一个样品的测量C，值进行比较。 DNA提取可被接受的三个条件为，回归线的斜率在一3.*～一3.1之间；判定系数（R"）应大于或等于 0.98；测量C，和推算C，的差△C，应小于0.5。 每个稀释梯度得到的两个PCR平行的C.值用于A.3的评价。

不同抑制剂验证结果判定的示例DBJ*1∕T 1*9-2018 陕西省城镇住区公共服务设施配置标准，见图A.1～图A.*。 注：图中“工作稀释度”是未经稀释的样品DNA提取物

RB/T00*2019

（资料性附录） DNA提取浓度对实际LOD的影响