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HJ 347.2-2018 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法简介：

HJ347.2-2018 是中国环境监测标准中关于水质中粪大肠菌群测定的规定，其中多管发酵法是一种常用的检测方法。这种方法主要用于检测水样中大肠菌群的数量，大肠菌群通常被视为人体粪便污染的一个重要指标，对于评估水体的卫生状况具有重要意义。

多管发酵法的基本原理是：首先，将待测水样通过过滤或沉淀等方法去除悬浮物，然后将滤液接种到预先配置的培养基上，如多管发酵培养基。培养基中含有一种叫做伊红美蓝的指示剂，它能与大肠菌群产生的胆碱盐反应，使培养基呈现黑色。然后将接种后的培养基放入恒温培养箱中进行培养，经过一段时间后，大肠菌群会生长并形成黑色菌落。

检测时，会定期检查培养基，计数黑色菌落的数量。每毫升水样中大肠菌群的数量，通常以MPN（Most Probable Number，可能数）表示。该方法操作简单，但需要一定的时间来等待培养结果，适用于常规水质监测。

请注意，实际操作时需要严格遵守标准操作规程，确保实验的准确性和可靠性。

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水质粪大肠菌群的测定多管发酵法

粪大肠菌群的测定多管发酵

本标准规定了测定水中粪大肠菌群的多管发酵法 本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定 本方法的检出限：12管法为3MPN/L：15管法为20MPN/L。

本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件GB∕T 15064.1-1994 显象管石墨乳试验方法 固形分、挥发分、灰分和pH值试验方法，其有效版本适用于本 标准。 GB/T14581水质湖泊和水库采样技术指导 HJ494水质采样技术指导 HJ/T 91地表水和污水监测技术规范

下列术语和定义适用于本标准。 3.1 粪大肠菌群fecalcoliforms 又称耐热大肠菌群（thermotolerantcoliforms）。44.5℃培养24h，能发酵乳糖产酸产气 的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。 3.2 最大可能数mostprobablenumber（MPN） 又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学原理，根据一定体 积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物 存在的数量（单位体积存在目标微生物的最大可能数）

将样品加入含乳糖蛋白陈培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中 生长紧殖分解乳糖产酸产气，产生的酸使漠甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入 到管中，指示产气。44.5℃复发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长， 最后产气的细菌确定为是粪大肠菌群。通过查MPN表，得出粪大肠菌群浓度值

除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂或生物试剂，实验用水为蒸馏 水或去离子水。

6.1乳糖蛋白陈培养基

蛋白陈 10g 牛肉浸膏 3g 乳糖 5g 氯化钠 5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 将蛋白陈、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml水中，调节pH至7.2～7.4， 再加入1.6%漠甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置小玻璃管的试管中，115℃ 高压蒸汽灭菌20min，储存于冷暗处备用。也可选用市售成品培养基。 6.2三倍乳糖蛋白陈培养基：称取三倍的乳糖蛋白陈培养基（6.1）成分的量，溶于1000ml 水中，配成三倍乳糖蛋白陈培养基，配制方法同上。 6.3EC培养基

将蛋白陈、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml水中，调节pH至7.2～ 再加入1.6%漠甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置小玻璃管的试管中， 高压蒸汽灭菌20min，储存于冷暗处备用。也可选用市售成品培养基。 6.2三倍乳糖蛋白陈培养基：称取三倍的乳糖蛋白陈培养基（6.1）成分的量，溶于100 水中，配成三倍乳糖蛋白陈培养基，配制方法同上。 6.3EC培养基

6.8乙二胺四乙酸二钠溶液：P（C1oH14N2O:Na2:2H2O）=0.15g/ml

安四乙酸二钠溶液：P（C1oH14N2O:Na2:2H20）=0.15g/ml

称取15g乙二胺四乙酸二钠（6.6），溶于适量水中，定容至100ml，此溶液可保存30d.

7.1采样瓶：500ml带螺旋帽或磨口塞的广口玻璃瓶。 7.2高压蒸汽灭菌器：115℃、121℃可调。 7.3恒温培养箱或水浴锅：允许温度偏差37℃土0.5℃、44℃土0.5℃。 7.4pH计：准确到0.1pH单位。 7.5接种环：直径3mm。 7.6试管：300ml、50ml、20ml。 7.7一般实验室常用仪器和设备。 注：玻璃器皿及采样器具试验前要按无菌操作要求包扎，121℃高压蒸汽灭菌20min备用

采样后应在2h内检测，否则，应10℃以下冷藏但不得超过6h。实验室接样后，不能 立即开展检测的，将样品于4℃以下冷藏并在2h内检测

9. 1. 115 管法

将样品充分混匀后，在5支装有已火菌的5ml倍乳糖蛋日陈培养基（6.2）的试管中 （内有倒管），按无菌操作要求各加入样品10ml，在5支装有已灭菌的10ml单倍乳糖蛋白 陈培养基（6.1）的试管中（内有倒管），按无菌操作要求各加入样品1ml，在5支装有已灭 菌的10ml单倍乳糖蛋白陈培养基（6.1）的试管中（内有倒管），按无菌操作要求各加入样 品0.1ml。 对于受到污染的样品，先将样品稀释后再按照上述操作接种，以生活污水为例，先将样 品稀释104倍，然后按照上述操作步骤分别接种10ml、1ml和0.1ml。15管法样品接种量 参考表见表1。 当样品接种量小于1m时，应将样品制成稀释样品后使用。按无菌操作要求方式吸取 0ml充分混匀的样品，注入盛有90ml无菌水（6.4）的三角烧瓶中，混匀成1:10稀释样品 吸取1:10的稀释样品10ml注入盛有90ml无菌水的三角烧瓶中，混匀成1:100稀释样品。 其他接种量的稀释样品依次类推。 注：吸取不同浓度的稀释液时，每次必须更换移液管。 生活饮用水等清洁水体也可使用12管法

表115管法样品接种量参考表

9. 1. 212 管法

将样品充分混匀后，在2支装有已灭菌的50ml三倍乳糖蛋白陈培养基（6.2）的大试管 中（内有倒管），按无菌操作要求各加入样品100ml，在10支装有已灭菌的5ml三倍乳糖 蛋白陈培养基（6.2）的试管中（内有倒管），按无菌操作要求各加入样品10ml

将接种（9.1）后的试管，在37℃土0.5℃下培养24h土2h。 发酵试管颜色变黄为产酸，小玻璃倒管内有气泡为产气。产酸和产气的试管表明试验阳 性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性

轻微振荡在初发酵试验（9.2）中显示为阳性或疑似阳性（只产酸未产气）的试管，用 经火焰灼烧灭菌并冷却后的接种环（7.5）将培养物分别转接到装有EC培养基（6.3）的试 管中。在44.5℃土0.5℃下培养24h土2h。转接后所有试管必须在30min内放进恒温培养箱 或水浴锅（7.3）中。培养后立即观察，倒管中产气证实为粪大肠菌群阳性。

9.4.2阳性及阴性对照

要用无菌水（6.4）按照步骤9.1～9.3进行实验室

将粪大肠菌群的阳性菌株（如大肠埃希氏菌Escherichiacoli）和阴性菌株（如产气肠 菌Enterobacteraerogenes）制成浓度为3003000MPN/L的菌悬液，分别取相应体积的菌 悬液按接种（9.1）的要求接种于试管中，然后按初发酵试验（9.2）和复发酵试验（9.3）要 求培养，阳性菌株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无 效，应查明原因后重新测定，

接种12份样品时，查附录A中表A.1可得每升粪大肠菌群MPN值。 接种15份样品时，查附录A中表A.2得到MPN值，再按照公式（1）换算样品中粪大 场菌群数（MPN/L）：

MPN值×100 C:

式中：C一 二样品中粪大肠菌群数，MPN/L； MPN值一一每100ml样品中粪大肠菌群数，MPN/100ml； 100—为10×10ml，其中，10将MPN值的单位MPN/100ml转换为MPN/L，10ml 为MPN表中最大接种量 f一实际样品最大接种量，ml。

测定结果保留至整数位，最多保留两位有效数字，当测定结果≥100MPN/L时，以科学

计数法表示；当测定结果低于检出限时，12管法以“未检出”或“<3MPN/L”表示；15 管法以“未检出”或“<20MPN/L”表示。粪大肠菌群检验记录及报告推荐格式参见附录 B

6个实验室对低浓度（地下水，浓度均值为54MPN/L）、中浓度（地表水，浓度均值 为2.7×104MPN/L）和高浓度（生活污水，浓度均值为2.8×107MPN/L）三个不同浓度粪 大肠菌群的实际样品和有证标准样品（浓度为3670MPN/L，可接受范围为330 7710MPN/L）进行了6次重复测定：实验室内相对标准偏差范围分别为2.3%～3.8%、2.0% 1%、1.1%～5.4%和5.1%~17%；实验室间相对标准偏差分别为3.4%、11%、1.6%和5.4%； 实验室间95%置信区间见表2。

表2实验室间95%置信区间

12质量保证和质量控制

更换不同批次培养基时要进行阳性和阴性菌株检验，将粪大肠菌群的阳性菌株（如大肠 埃希氏菌Escherichiacoli）和阴性菌株（如产气肠杆菌Enterobacteraerogenes）制成浓度为 300～3000MPN/L的菌悬液。若使用的是定性标准菌株，配制方法为先进行预实验，摸清浓 度后按目标为300～3000MPN/L稀释；若使用的是定量标准菌株，则可按照给定值直接稀 释。稀释后分别取相应水量的菌悬液按接种（9.1）的要求接种于试管中，然后按初发酵试 验（9.2）和复发酵试验（9.3）要求培养，阳性菌株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现阴性 反应

12. 2. 1空自对照

每次试验都要用无菌水做实验室空百测定（9.4.1），培养后的试管中不得有任何变色反 应。否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定

12. 2. 2阳性及阴性对照

定期按照9.4.2进行阳性及阴性对 株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现 阴性反应，否则[名企]建筑工程施工技术指引一本通937P，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。

使用后的废物及器皿须经121℃高压蒸汽灭菌30min或使用液体消毒剂（自制或市售） 灭菌。灭菌后，器血方可清洗，废物作为一般废物处置。

附录A （资料性附录） 最大可能数（MPN）表

表A.112管法最大可能数（MPN）表

注：接种2份100ml样品，10份10ml样品，总量

表A.215管法最大可能数（MPN）表

注1：接种5份10ml样品、5份1ml样品、5份0.1ml样品。 注2：如果有超过三个的稀释度用于检验，在一系列的十进稀释当中，计算MPN时二级建造师考试工程施工管理重点内容归纳（25页），只需要用其中依次三个 的稀释度，取其阳性组合。选择的标准是：先选出5支试管全部为阳性的最大稀释(小于它的稀释度也全部为 阳性试管)，然后再加上依次相连的两个更高的稀释。用这三个稀释度的结果数据来计算MPN值。