标准规范下载简介

GB_T 40170-2021 质粒抽提及检测通则.pdf简介：

GB_T 40170-2021是中国国家标准中的一个技术规范，全称为《质粒DNA抽提及检测通用技术要求》，该标准主要适用于生物技术领域，特别是基因工程和分子生物学研究中，质粒DNA的提取和检测过程。质粒是细菌、真菌、病毒等生物体内的环状DNA分子，常用于基因克隆、遗传改造等研究。

该通则详细规定了质粒DNA的抽提方法，包括但不限于化学抽提、机械抽提、生物抽提等，以确保抽提的DNA质量和纯度满足科研要求。同时，也对DNA的完整性、浓度、纯度、质量分数等参数的检测方法进行了规定，如紫外光谱法、凝胶电泳、PCR检测等，以保证质粒DNA的准确性和有效性。

GB_T 40170-2021的发布，旨在规范和统一质粒DNA操作流程，提高科研实验的准确性和可重复性，对于生物技术相关行业的实验室操作具有重要的指导意义。

GB_T 40170-2021 质粒抽提及检测通则.pdf部分内容预览：

下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

GB/T 40170—2021

DNase：脱氧核糖核酸酶（Deoxyribonuclease） HPLC：高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography） RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）

质粒作为基因工程重组技术的常用载体，质粒的质量（浓度、构型、纯度、内毒素含量)是蛋白表达 转染效率的关键。获得高纯度的质粒，需要实验者理解质粒提取原理，针对不同菌种、不同性质 小的质粒·选用恰当的方法·有效地控制提取过程中的各种影响因素

利用离子去污剂、强碱等试剂裂解宿主细胞，使得质粒从细胞中释放出来，再弃除质粒中的蛋白、基 因组DNA等杂质JGJT 326-2014标准下载，经异丙醇或乙醇沉淀DNA，最终得到纯化质粒

7.1.2抽提方法分类及特点

表1几种质粒抽提原理及特点

GB/T 40170—202

硅胶柱法抽提操作步骤按照商业吸附柱抽提试剂盒说明书进行。

磁珠吸附法抽提操作步骤按照商业磁珠法

离子交换法抽提操作步骤按照附录B进行

质粒的检测包括液体外观、序列验证、浓度测定、纯度检测、超螺旋比例检测、残余RNA和残余基 因组DNA检测、细菌内毒素检测、限制酶酶切分析、细菌检测等项目，根据不同的项目采用不同的检测 方法。

肉眼观察，参考结果见附

GB/T34265执行，对质粒进行序列测定，参考结

按照GB/T34796执行，参考结果见附录C

GB/T 40170—2021

按照GB/T34796执行，OD2so/OD20在1.8至2.0之间，OD26o/OD230在2.0至2.5之间，琼脂糖 泳法检测无其他杂带，肉眼可见，可用于后续试验。参考结果见附录C。

采用高效液相色谱法检测质粒超螺旋比例，利用超螺旋质粒和RNA，基因组DNA碎片的疏水性 质的差异，将待测样超螺旋质粒和其余DNA、RNA分离。方法、设备运行参数按照附录D执行，根据 检测结果计算目标峰面积占所有峰面积的比值。参考结果见附录C。

8.3.6残余RNA、残余基因组DNA的检测

采用琼脂糖凝胶电泳法对残余RNA、残余基因组DNA进行检测，肉眼可见，且限制酶酶切分析 消失。参考结果见附录C

8.3.7细菌内毒素检测

采用鲨试剂检测法检测细菌内毒素，检测方法见中华人民共和国药典：2020年版.四部，细菌内 金查法。参考结果见附录C。

质粒抽提和检测技术人员应由具备分子生物学、微生物学及相关教育背景的人员担任， 涉及质粒抽提及检测的技术人员应该完全了解菌种培养的相关工作，应掌握质粒检测等相关理论 知识和相关试验基础。 检测人员应该接受适当的内部或者外部培训，培训的内容应该包括但是不限于： 菌种培养技术，包括无菌实验室操作技能； 一掌握质粒分子生物学特性； 环境控制； 一定期进行人员的测量能力考核，

质粒抽提和检测技术人员应由具备分子生物学、微生物学及相关教育背景的人员担任。 涉及质粒抽提及检测的技术人员应该完全了解菌种培养的相关工作，应掌握质粒检测等相关理论 知识和相关试验基础 检测人员应该接受适当的内部或者外部培训，培训的内容应该包括但是不限于： 菌种培养技术，包括无菌实验室操作技能； 一掌握质粒分子生物学特性； 环境控制； 一定期进行人员的测量能力考核，

检测仪器应符合预期要求的性能参数和规格。 仪器设备的使用应严格按照标准操作程序进行操作。主要分析设备的操作规程应制定得详细 定期对仪器设备进行检测或校准

GB/T 40170—202

质粒抽提及检测涉及的相关试剂需从具备专业资质并经过验证核实的供应商处采购，且具备检验 合格证明文件。 检测试剂应严格按照使用方法正确使用 检测试剂的使用应具有严格的文件记录制度，包括试剂的标识、使用时间等信息

质粒抽提后应附抽提和检测报告单或等同的指导性文件，格式见附录E。文件内容应至少包括以 下部分： a）名称； b）总量； c）外观； d）浓度； e)OD260/ODzso； ）OD260/ODz30； g）超螺旋比例； h）RNA残留； i）基 基因组DNA残留； j）细菌检测； k）细菌内毒素检测； 1）测序； m）限制酶酶切分析； n)标签； 0）保存条件及期限。

弃物处理按照GB/T27403和GB/T19495.2中

GB/T 40170—2021

A.2.1分步收集2mL～4mL菌液到2mL离心管中，12000r/min，离心1min，弃上清。 A.2.2向离心管中加人250μL溶液1（已加人RNaseA)，涡旋振荡使细胞重悬。 A.2.3向离心管中加人250pL溶液2，温和翻转离心管6次～10次，使菌体充分裂解，液体变得澄清 A.2.4向离心管中加人350pL溶液3，温和翻转离心管6次～10次，此时可观察到管内出现白色絮状 物，12000r/min室温离心10min。 A.2.5取上清于新的2.0mLEP管中.并记录体积

A.2.6加等体积的苯酚/氯仿溶液，充分振荡混匀，12000r/min离心10min。 A.2.7重复A.2.6。 A.2.8小心吸取上清于新的2.0mLEP管中，加等体积的异丙醇混匀，12000r/min离心10min。 A.2.9小心弃去上清。 A.2.10加入1mL75%乙醇清洗沉淀，12000r/min离心1min，弃去上清。 A.2.11置于超净工作台将残留乙醇吹干，加50μL~100uLddHO溶解，一20C保存。

GB/T 40170—2021

B.2.1从转化的细菌平板中挑取单菌落，接种到4mL液体培养基（含相应的抗生素），37C，220r/min培 养6h。 B.2.2取100μL上述菌液接种到300mL选择性培养基中，37C，220r/min，培养16h。 B.2.3收集B.2.2中菌液于500mL离心杯中，4°C，8000g离心10min。 B.2.4弃上清，并倒扣在吸水纸上，加人30mL，4°C预冷的BufferP1（已加人RNaseA)，反复吹打沉 淀直至完全混匀。 B.2.5加人30mL细胞裂解液BufferP2，轻柔地上下颠倒混匀4次～6次，在室温下孵育时间不要超 过5min。 B.2.6加人30mL预冷的BufferP3，立即颠倒混匀6次～8次（动作要轻柔），在冰上孵育10min， 4°℃，8000g离心20min。 B.2.7在层析柱的顶端加滤纸，沿滤纸边缘缓慢加人20mL的BufferQBT（平衡层析柱）。 B.2.8将B.2.6中的上清小心移到层析柱中（不可将沉淀绕动），让液体自由流下。

B.2.9加人20mLBufferQC清洗层析柱一次。 B.2.10加人20mLBufferQF洗脱DNA，准备对应的50mL的离心管分别收集洗脱液。 B.2.11加入0.7倍体积异丙醇，上下颠倒混匀，在冰上孵育30min以上。 B.2.124°℃，8000g离心20min。 B.2.13小心弃去上清。注意：不要将沉淀倒掉。 B.2.14加人2mL75%乙醇清洗沉淀，4°℃，8000g离心10min，弃上清。 B.2.15重复B.2.14。 B.2.16置于超净工作台将残留乙醇吹干，加人500uL的TE溶液或灭菌水溶解DNA

GB/T 40170—2021

质粒检测参数及参考结果见表C.1。

TB／T 3521-2018标准下载附录C （资料性） 质粒检测参数及参考结果

附录C （资料性） 质粒检测参数及参考结果

页粒检测参数及参考结果 览表

GB/T 40170—202

河南省建设工程项目联合测绘技术导则(试行)（河南省公司给建设项目审批制度改革领导小组办公室2020年10月1日起实施）.pdfGB/T 40170—2021

表E.1 质粒报告单格式

国家药典 出版社，2020